Struktur DNA, Regulasi Gen, Kerusakan dan Pemulihan DNA

Era penemuan materi genetik telah dibuka oleh F. Meischer dengan menggunakan mikroskop sederhana, dia telah menetapkan bahwa bahan aktif yang ada di dalam nucleus disebut sebagai nuclein. Peneliti ini belum bisa menetapkan apakah nuclein in kromosom ataukah DNA. Kromosom ditemukan pad awal abad ke-19 merupakan struktur seperti benang pada nucleus sel eukariot yang nampak pada saat sel mulai membelah. Kromosom berjumlah diploid pada setiap selnya, dan pada autosomal maupun seks-kromosom membawa gen-gen yang berpasangan kecuali pada kormosom-Y.DNA (Gen)

Gen adalah unit heriditas suatu organisme hidup. Gen ini dikode dalam material genetik organisme, yang kita kenal sebagai molekul DNA, atau RNA pada beberapa virus, dan ekspresinya dipengaruhi oleh lingkungan internal atau eksternal seperti perkembangan fisik atau perilaku dari organisme itu. Gena tersusun atas daerah urutan basa nukleotida baik yang mengkode suatu informasi genetik (coding-gene-region as exon) dan juga daerah yang tidak mengkode informasi genetik (non-coding-gene region as intron), hal ini penting untuk pembentukan suatu protein yang fungsinya diperlukan di tingkat sel, jaringan, organ atau organisme secara keseluruhan. Molekul DNA membawa informasi heriditas dari sel dan komponen protein (molekul-molekul historin) dari kromosom mempunyai fungsi penting dalam pengemasan dan pengontrolan molekul DNA yang sangat panjang sehingga dapat muat di dalam nucleus dan mudah diakses ketika dibutuhkan. Selama reproduksi, jumlah kromosom yang haploid dan material genetik DNA hanya separuh dari masing-masing parental, dan disebut sebagai genom.

Struktur DNA

Pada tahun 1953, James Watson, and Francis Crick telah membuka wawasan baru tentang penemuan model struktur DNA. Publikasi dari model double heliks DNA ini disusun berdasarkan penemuan :

1. Penemuan struktur asam nukleat dari Pauling dan Corey
2. Pola difraksi DNA (single-crystal X-ray analysis) dari Willkins dan Franklin
3. Pola perbandingan jumlah A-T, G-C (1:1) dari Chargaff atau dikenal

Kemudian immature mRNA ini diolah pada proses splicing dengan menggunakan smallnuclearRNA (snRNA) complex yang akan memotong hanya daerah intron, dan semua exon akan disambungkan menjadi satu urutan gen utuh tanpa non-coding area dan disebut sebagai mature mRNA. Pada tahap berikutnya, mRNA ini diproses lebih lanjut pada proses translasi di dalam ribosom, dalam tiga tahapan pokok yaitu inisiasi sebagai mengawasi sintesis polipeptida dari kodon AUG yang ditranslasi sebagai asam amino dari kodon AUG yang ditranslasi sebagai asam amino methionine. Proses ini berlangsung dengan bantuan initiation faktor (IF-1, IF-2, dan IF3) dan enzim tRNA-methionine synthethase (pada bakteri diawali olehformylmethionine) sehingga tRNA dan asam amino methionine membentuk ikatan cognate dan bergerak ke ribosom tempat sintesis protein berlangsung. Langkah selanjutnya adalah elongasi atau pemanjangan  polpeptida sesuai dengan urutan kodon yang dibawa mRNA

Regulasi Gen

Sebelum penemuan DNA, telah diketahui bahwa gen adalah unit fisik dan fungsional dari hereditas yang mengandung informasi untuk sintesis protein. Jadi  gen mengandung informasi hereditas. Gen-gen membawa informasi yang harus dikopi secara akurat untuk ditransmisikan kepada  generasi berikutnya. Sekarang pertanyaannya adalah bagaimana suatu informasi dapat diformulasikan dalam bentuk molekul kimia? Bagaimana molekul tersebut dapat dikopi secara akurat? Pada tahun 1940-an, peneliti menemukan bahwa informasi genetik terutama terdiri dari instruksi untuk membentuk protein. Protein adalah molekul makro yang berperan dalam hampir semua fungsi sel yaitu; sebagai bahan pembangun struktur sel dan membentuk enzim-enzim yang mengkatalisis reaksi-reaksi kimia di dalam sel; meregulasi ekspresi gen, memungkinkan sel untuk bergerak dan berkomunikasi antar sel.

Jadi fungsi paling penting dari DNA adalah membawa gen yang mengandung informasi yang menentukan jenis protein yang harus disintesis, kapan, dalam tipe sel yang mana, dan seberapa banyak jumlah protein yang harus disintesis.

Dengan semakin berkembangnya pengetahuan molekuler maka definisi dari gen adalah:

• Keseluruhan sekuen asam nukleat yang dapat ditranskrip menjadi RNA fungsional dan protein, pada waktu dan tempat yang tepat selama pertumbuhan dan perkembangan organisma
• Komposisi gen adalah; daerah pengkode (exon dan intron) yang mengkode RNA atau protein + sekuen-sekuen pengaturan (regulatory sequences; termasuk. Promoter yang menginisiasi terjadinya transkripsi, enchancer/silencer yang menentukan tinggi rendahnya aktivitas transkripsi, polyadenylation site, splicing sites serta signal terminasi  transkripsi)
• Produk gen:

RNA yang kemudian ditranslasi menjadi protein hanya RNA seperti rRNA, snRNA, snoRNA dan miRNA

• Satu gen mempunyai potensi menghasilkan banyak produk karena adanya;

Promoter-promoter yang berbeda alternativesplicing.

Pemulihan DNA merujuk kepada himpunan proses dari mana sel mengenal pasti dan membetulkan kerusakan pada molekul DNA yang mengkodekan genomnya. Dalam sel manusia, kedua-dua aktiviti metabolic normal dan faktor perserikatan seperti cahaya UV mampu menyebabkan kerusakan DNA, menyebabkan sehingga 1 juta lesion molekul individu setiap sel sehari.

Banyak luka ini menyebabkan kerusakan struktur kepada molekul DNA dan boleh mengubah atau menghapuskan keupayaan sel untuk mentranskripsikan  gen yang menjejalkan pengkod DNA. Luka ini menggalakkan kemungkinan mutasi berbahaya pada genom sel, yang menjejaskan terus hidup sel-sel selanjutnya aktif agar ia mampu bertindak balas dengan pantas kepada apa-apa kerusakan struktur  DNA.

Kadar pemulihan DNA bergantung kepada banyak faktor, termasuk jenis sel, dan perserikatan extraseluler. Sel yang mengumpulkan sejumlah besar kerusakan DNA, atau tidak lagi mampu memperbaiki kerusakan yang berlaku  kepada DNA nya dengan berkesan, boleh menjalani salah satu dari tiga keadaan :

1. Memasuki keadaan bertapa tidak boleh undur, dikenali sebagai senescense
2. Bunuh diri sel, juga dikenali sebagai apoptosis atau kematian sel diprogram
3. Pembagian sel  luar kawal, yang boleh mendorong kepada pembentukan tumor yang menjadi barah.

Kepunyaan memperbaiki DNA sesuatu sel amat penting bagi keutuhan genomnya dan dengan itu kepada fungsi normalnya dan bagi sesuatu organisma. Banyak gen yang awalnya menunjukkan pengaruh jangka hayat terbukti terbabit dalam perlindungan dan pemulihan kerusakan  DNA. (1) kegagalan membaiki luka pada sel yang membentuk gamet boleh memperkenalkan mutasi pada genom anak. Dan dengan itu mempengaruhi kadar evolusi.

Kerusakan DNA

Kerusakan DNA, akibat faktor perserikatan dan proses metabolis normal dalam sel, berlaku pada kadar 1000 hingga 1.000.000 luka molekul setiap sel setiap hari. 1) sungguhpun ini hanyalah 0.000165% dari pada genom manusia yang dianggarkan 6 billion asas (3 billion pasangan asas), luka tidak dibaiki dalam gen penting (seperti gen pemendam tumor) mampu melumpuhkan keupayaan sel bagi meneruskan fungsi dan meningkatkan kemungkinan pembentukan timor.

Sejumlah besar kerusakan DNA memberi  kesan kepada struktur utama helix berkembar, yaitu asas itu sendiri diubah secara kimia. Pengubahan ini seterusnya mengganggu struktur helix biasa dengan memperkenalkan ikatan kimia bukan-asal atau tambahan lain (bulky adducts) yang tidak sesuai dengan helix berkembar piawaian. Tidak seperti protein dan RNA, DNA biasanya tidak memiliki struktur berlapis (tertiary structure) dan dengan itu kerusakan atau gangguan tidak berlaku pada aras tersebut. DNA, sebaliknya supergulung dan bergulung sekitar protin dibungkus yang dikenali sebagai histone, dan kedua struktur terdedah kepada kesan kerusakan DNA.

Pemulihan DNA Dan Barah

Mutasi diwarisi yang memberi kesan kepada gen pemulih DNA berkait rapat dengan resiko barah pada manusia. Barah kolorektal Nonpoliposis diwarisi (hereditary nonpolyposis colorectal cancer) (HNPCC) berkait rapat dengan mutasi khusus dalam laluan pemulihan salah pasang DNA. BRCA 1 dan BRCA 2, dua mutasi terkenal memberikan resiko penyakit barah payu darah yang tinggi kepada pembawa, keduanya dikaitkan dengan sejumlah besar laluan pemulihan DNA, terutamanya NHEJ dan pengabung homologous.

Prosedur terapi barah seperti kemhoterapi dan radiotherapy berfungsi dengan melapisi keupayaan sel bagi membaiki kerusakan DNA, menyebabkan kematian sel. Sel yang membagi dengan pantas pada kebiasaannya sel  barah-biasanya mendapat kesan yang dikehendaki. Kesan sampingan  adalah sel bukan barah lain tetapi membagi dengan pantas seperti sel stem (stem cell) dalam sum-sum tulang turut terjejas. Rawatan barah moden cuba menghadirkan kerusakan DNA kepada tisu dan sel yang berkait dengan barah, sebagai Hukum Ekivalen Chargaff;

• Jumlah purin sama dengan primidin
• Banyaknya adenine sama dengan timin, juga jumlah glisin sama dengan sitosin

DNA terbentuk dari empat tipe nukleotida, yang berikatan secara kovalen membentuk rantai polinukleotida (rantai DNA atau benang DNA) dengan tulang punggung gula fosfat tempat melekatnya basa-basa. Dua rantai polinukleotida saling berikatan melalui ikatan hydrogen antara basa-basa nitrogen dari rantai yang berbeda. Semua basa berada di dalam double helix dan tulang punggung gula-fosfat berada di bagian luar. Purin selalu berpasangan dengan primidin (A-T,G-C). perpasangan secara komplemen tersebut memungkinkan pasangan basa dikemas dengan susunan yang paling sesuai. Hal ini bisa terjadi bila kedua rantai polinukleotida tersusun secara antiparalel.

Untuk memaksimumkan pengemasan pasangan basa  tersebut, kedua tulang punggung gula-fosfat tersebut berpilin membentuk double helix, dengan satu putaran komplementer setiap 10 pasang basa. Polaritas dari rantai DNA ditunjukkan dengan sebutan ujung 5` dan ujung 3`. Arah pembacaan basa nukleotida dari ujung 5` menuju ujung 3`.

Sintesis Protein

Proses sintesis protein terbagi atas transkripsi dan tranlasi. Seperti kita ketahui DNA sebagai media untuk proses transkripsi atau gen berada di kromosom dan terikat oleh protein histon. Saat menjelang proses transkripsi berjalan, biasanya didahului signal dari luar akan kebutuhan suatu protein atau molekul lain yang dibutuhkan untuk proses pertumbuhan, perkembangan, metabolisme dan fungsi lain di tingkat sel maupun jaringan. Kemudian RNA polymerase II akan mendatangi daerah regulator element dari gen yang akan  ditranskripsi. Kemudian RNA polymerase ini akan menempel (binding) di daerah promoter spesifik dari gene yang akan disintesis proteinnya, daerah dari titik inisiasi (+1) yang mengandung urutan TATA-Box sebagai basal promoter. Setelah itu, polymerase ini akan membuka titik inisiasi (kodon ATG) dari gene tersebut dan mengkopi semua informasi secara utuh baik daerah exon maupun intron, dalam bentuk molekul immature mRNA (messenger RNA) samaada dengan cara fizikal (menumpuk agen theraputik di kawasan barah sahaja) atau melalui cara biokimia (menggunakan ciri-ciri khas bagi sel barah pada badan).

Kadar Pertukaran Evolusi

Kadang kala, kerusakan DNA tidak diperbaiki atau diperbaiki oleh mekanisme cenderung silap yang menyebabkan pertukaran dari jujukan asal. Apabila ini berlaku, mutasi mungkin.

Dikekalkan kepada genom sel anak. Sekiranya ini berlaku pada sel garis hukum (germ line) yang akhirnya menghasilkan gamet, mutasi itu mempunyai peluang untuk diturunkan kepada anak organisme tersebut. Kadar evolusi dalam spesies tertentu (atau lebih tepat lagi, dalam gen tertentu) adalah fungsi kadar mutasi. Akibatnya, kadar dan ketetapannya mekanisme pemulihan DNA mempunyai pengaruh ke atas proses pertukaran evolusi.

Penyisipan Gen Inhibitor a-amilase Pada Plasmid Biner pCambia 1301

Salah satu upaya untuk merakit tanaman dengan sifat tertentu adalah dengan menggunakan teknik rekayasa genetik. Teknik ini dapat digunakan untuk menyisipkan gen yang berasal dari tanaman, bakteri,  virus atau hewan. Pemanfaatan gen yang berasal dari organisme lain dilakukan apabila tidak ada sumber gen yang diperlukan dari plasma nutfah tanaman.

Salah satu contoh gen kandidat adalah gen inhibitor a-amilase (gen a-ai). Gen ini telah berhasil diisolasi dari kacang buncis (phaseolus vulgaris) oleh Chrispeels dan Raikhel (1991). Berdasarkan penelitian, protein yang dihasilkan oleh gen tersebut bersifat racun terhadap serangga dari kelompok Callosobruches, tetapi tidak beracun terhadap mamalia. Ishimoto dan Kitamura (1989) serta Huesing et al. (1991) melaporkan bahwa pakan buatan dari tepung adzuki bean dan tepung kacang tunggak yang telah dibubuhi a-ai dapat menghambat pertumbuhan hama gudang.

Salah satu faktor yang diduga  menentukan keberhasilan transfer gen ke tanaman adalah teknik transfer gen. transfer gen asing  melalui agrobacterium dapat terjadi apabila bakteri ini membawa plasmid biner yang mengandung struktur DNA khusus (T-DNA) Fragmen DNA (gen tertentu) yang disisipkan  ke dalam T-DNA akan ditransfer ke dalam genom tanaman secara efisien dan akan dipertahankan kestabilannya (Smith dan Hood 1995: an et. al. 1988). Saat ini, efisiensi transformasi melalui agrobacterium terjadi pada tanaman dikotil dengan stabilitas integrasi pada kromosom, ekspresi dan pewarisan  yang mantap. Berdasarkan hal tersebut, maka perlu dilakukan transformasi gen a-ai ke dalam tanaman inang hama gudang.

Berdasarkan faktor-faktor di atas maka perlu dikemukakan penyisipan gen a-ai pada plasmid biner yang mempunyai Tersebut-DNA dan mempunyai berinteraksi ke dalam genon tanaman. Pada penelitian ini dilakukan praktikan plasmid biner yang mengandung gen a-ai, sehingga dengan mentransfer T-DNA yang sudah mengandung gen a-ai diharapkan dapat terintegrasi pada genom tanaman.

Damak dan Bullock (1993) menyebutkan bahwa terdapat dua tahap penting dalam proses penyisipan fragmen DNA (gen interes) ke plasmid vektor, dan ligasi kembali vektor tanpa sisipan (self-ligation). Ullrich et al. (1977) melaporkan bahwa adanya proses disfosforilasi dapat menurunkan terjadinya self-ligation. Listanto dan Wang (1996) berhasil menyisihkan gen cad ke dalam vektor pUb dengan persentase keberhasilan 30 %. Keberhasilan penyisipan gen a-ai pada plasmid pCambia 1301 belum pernah diteliti.

Penelitian ini  berfungsi untuk mendapatkan konstruksi gen a-ai pada plasmid biner pCambia 1301. konstruksi yang diperboleh pada penelitian ini dapat digunakan untuk transfer gen a-ai ke dalam genom tanaman melalui A.tumefaciens untuk mendapatkan sifat tahan terhadap hama gudang.